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随着科技进步和医学发展，许多过去让人们束手无策的疾病如今都逐一被缓解，甚至彻底治愈。然而，癌症——作为“众病之王”，却仿佛一道难以攻克的天堑，至今仍未完全被人类所战胜。

从传统的癌症治疗方法，如放疗和化疗，再到如今新兴的肿瘤治疗方法——靶向药物、溶瘤病毒以及免疫治疗，科学的进步为肿瘤患者带来了新的希望，但遗憾的是，这些方法并不能彻底解决癌症这一难题。因此，这也迫使人类不断开发更新、更高效的癌症治疗方法！

近日，以色列特拉维夫大学的研究人员在《Science》子刊《Science Advances》杂志上发表题为：CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy 的研究论文。

这项研究为世界首例证实CRISPR/Cas9系统可以有效治疗活体动物转移性癌症的研究。研究人员开发了一种新的基于脂质纳米颗粒（LNP）的CIRSPR递送系统——CRISPR-LNP，并在两种侵袭性和不可治愈的癌症类型——胶质母细胞瘤和卵巢癌中表现出良好的治疗效果。

CRISPR技术的迅速发展正在潜移默化地改变着生命科学研究领域乃至人类世界。目前，CRISPR技术已经广泛应用于基因编辑、基因治疗、核酸定位及核酸检测等领域。

其实从基因编辑方法被提出以来此领域就不乏热点，那么今天就带大家一起来探索一下基因魔剪的前世今生以及时下的研发热点。

基因编辑技术是一种通过使用靶序列特异性工程核酸酶来操纵真核基因组的新兴治疗手段，包括模型细胞系的开发、疾病机理的发现、疾病靶标的确定、转基因动植物的开发和转录调节。

由于基因编辑技术在促进基因组中序列的正确校正方面所具有的特殊优势，基于基因编辑的疗法正被积极地开发为治疗多种疾病的下一代治疗方法。到目前为止基因编辑系统历经3代，包括锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应子核酸酶（TALEN）和CRISPR/Cas9。

| 锌指核酸酶（ZFN）

通常基因插入/删除步骤包括（1）基因组的某确定区域双链断裂（DSB）；（2）修正缺陷内源基因或引入外源基因；（3）DSB修复。

真核生物中的DSB修复有两种内源性修复机制：非同源末端连接（NHEJ）或同源直接修复（HDR）。NHEJ在生物体内发生频率高，但准确性低。为了降低非特异性突变，提高基因编辑保真度，研发人员开发了一种工程核酸酶——锌指核酸酶（ZFN）。

ZFN技术诞生于1996年，直到2002年，Bibikova等第一次用ZFN的方法通过在果蝇中成功突变了yellow基因。ZFN是Cys2-His2锌指蛋白（ZFP）和衍生自FokI核酸内切酶的非特异性DNA限制酶的融合蛋白，可靶向的DNA裂解试剂，已被用作基因靶向工具，ZFPs在真核细胞中很常见，并与转录调控和蛋白质-蛋白质相互作用相关。

ZFN的DNA结合域通常含有3个独立的ZF重复结构，每个ZF结构能够识别3个碱基，因而一个锌指DNA结合域可以识别9bp特异性序列，ZFN二聚体（含6个锌指）可以识别18bp长度的特异性序列。ZFN诱导的双链断裂易受细胞DNA修复过程的影响，从而导致靶向诱变和靶向基因的替换均以非常高的频率进行。目前最常用的ZF结构为Cys2His2锌指。

| 转录激活子样效应子核酸酶（TALEN）

继ZFN后，第二代人工核酸酶技术——转录激活子样效应子核酸酶（TALEN）于2009年诞生。TALEN作为ZFN的替代品与ZFN类似，包含与目的DNA结合域融合的非特异性FokI核酸酶域，该DNA结合结构域由高度保守的氨基酸重复序列组成，这些重复序列来自由黄单胞菌细菌分泌的蛋白——转录激活子样效应物（TALE），包含33-35个氨基酸。

该技术利用TALE重复结构域中氨基酸序列与其靶位点核酸序列之间有着对应的“氨基酸—DNA”关系，从而能快速设计出特异性结合目的DNA的蛋白模块。目前，几乎所有工程TALE重复序列都使用四个具有高变残基NN、NI、HD、NG的域，分别识别G、A、C、T。

与ZFN相比，两者的成本都较高，TALEN的设计和使用相对简单，用时更短，虽然也存在脱靶效应，但TALENs比ZFNs特异性更高且细胞毒性更小。但值得一提的是，TALEN比ZFN大，大概3 kb的cDNA编码一个TALEN，而编码单个ZFN仅需1 kb，这使得TALEN的递送更具挑战性。

a. TALEN示意图；b. TALEN结合并切割为目标DNA位点上的二聚体

| 规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR/Cas9）

CRISPR / Cas系统是第三代基因编辑工具，是一种原核生物的适应性免疫系统，是细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，用来抵抗外源遗传物质的入侵，如噬菌体病毒和外源质粒等。

简单来说，病毒感染细菌后将自己的基因整合到细菌基因组内用以繁殖，并通常在复制完成后杀死宿主细胞，为了回避这个致命的威胁，细菌进化出了强大的适应性免疫系统—CRISPR/Cas，它由一系列高度保守的短DNA重复序列组成，通常为21–48 bp的回文序列或短的反向重复序列，这些序列之间被称为间隔子的可变序列片段间隔开，通常介于26-72 bp之间，CRISPR阵列的第三部分是前导序列，其位于第一个重复序列上游，富含AT，约为200-500bp，包括必需的启动子序列。Cas的全称是CRISPR associated，是CRISPR基因座相邻基因，编码Cas蛋白，Cas蛋白提供了从入侵元件中获取新间隔子并靶向入侵元件所需的酶促机制。

基于系统发生机制和特定Cas蛋白，CRISPR / Cas系统目前分为六种类型，I–III型是研究最多的。每种类型可进一步细分为不同子类型，如类型I由IA到IF类型组成。每种类型都由所谓的特征蛋白指定，该蛋白以特定类型保守，但 cas1和cas2基因似乎是通用的，被发现存在于大多数CRISPR/Cas系统中。Cas3、Cas9和Cas10分别充当I，II和III型的标志蛋白。CRISPR/Cas9是目前研究得最多也是应用最成熟的基因编辑工具。

近年来，CRISPR / Cas基因编辑技术得到了飞速发展，并已广泛应用于许多领域，特别是在具有巨大潜力的医学领域。毫无疑问，将基于CRISPR / Cas的基因组编辑技术转化为医学应用会对人类健康产生重大影响，而此技术也引领了分子生物学工具的一场革命。

想要深入了解基因编辑技术，必备的理论和实验基础不可缺少！

BIOX中学生生物探索挑战营，立足生命科学大方向，着眼于学科交叉与人类社会交互，全方位地 展示生命大学科的研究内容与前沿技术，并指导同学们系统完成一系列分子生物学与基因工程实验。同学们依托课程内容及文献资料，完成一份自己感兴趣的研究方向的研究计划书。